Elabscience生物素標(biāo)記試劑盒提供了標(biāo)記所需的全部試劑，能簡(jiǎn)單有效地對(duì)含有伯氨基（-NH2）分子的蛋白標(biāo)記。那么你知道Elabscience生物素標(biāo)記試劑盒怎么用嗎？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、實(shí)驗(yàn)物品

1. 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10 μL、2-20 μL、20-200 μL、200-1000 μL

2. 37°C 恒溫箱

3. 離心機(jī)（離心力可到 12000×g）

二、操作

1. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

（1）試劑耗材準(zhǔn)備：提前 20 min 從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫（注：不需要用到的試劑組分繼續(xù)放置在冰箱中）。

（2）超濾管浸潤(rùn)：向干燥的超濾管濾芯中加入 500 μL Labeling Buffer I，室溫放置 10 min 備用，在加入待標(biāo)記物之前棄去 Labeling Buffer I 即可（整個(gè)標(biāo)記過(guò)程中超濾管濾芯都應(yīng)該保持濕潤(rùn)）。

（3）溶解 NHS-Biotin：用 30 μL DMF 溶解 0.1 mg NHS-Biotin，靜置 10 min，待其充分溶解，此時(shí) NHS-Biotin 的濃度為 10 mM，蓋好管子備用。

2.標(biāo)記流程

3. 標(biāo)記步驟（本操作步驟按照 1 mg 蛋白的量進(jìn)行標(biāo)記）

（1）濃縮換液：將 Filter device 正置于配套 Collection tube 里，取 1 mg 待標(biāo)記蛋白加入 Filter device 中，并用 Labeling Buffer I 補(bǔ)充總體積到0.5 mL，蓋好 Filter tube，以 12000×g 的轉(zhuǎn)速離心 10 min，棄去Collection tube 中的液體。

注：

a) Filter device 的最大容積為 0.5 mL。

b) 如果1 mg蛋白體積大于0.5 mL，請(qǐng)分多次加入，離心超濾濃縮。

c) 如果待標(biāo)記物中含有游離的氨基（Tris，氨基酸或者其他干擾物，需要用 Labeling Buffer I 反復(fù)超濾確保其去除干凈）。

（2）回收定量：將Filter device倒置于配套Collection tube里，1000×g離心2 min，回收濃縮換液后的蛋白，取出 Filter device，向Collection tube 中加入適量 Labeling Buffer I至蛋白濃度約為2 mg/mL，同時(shí)在Filter device中加入0.5 mL Labeling Buffer I，置于管架上備用。

（3）標(biāo)記反應(yīng)：立即向蛋白溶液中加入 26.6 μL 的 10 mM NHS-Biotin，輕輕吹打混勻，蓋上蓋子密封，放入 37°C 恒溫箱中避光溫育 30 min。

（4）封閉終止：按比例每 100 μg 蛋白加入 10 μL 的 1 M Tris（pH 8.7），混勻后室溫放置 10 min。

（5）超濾純化：加入適量的1×PBS至上述反應(yīng)液中，使終體積為0.5mL，輕輕吹打混勻，將反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)移至甩干的 Filter device（若上述反應(yīng)液已超過(guò) 0.5 mL，可超濾后分多次轉(zhuǎn)移至甩干的 Filter device中），并與 Collection tube 配套后蓋好 Filtration tube，12000× g的轉(zhuǎn)速離心 10 min~30 min。后棄去 Collection tube 中液體，向Filter device中補(bǔ)足1×PBS至500 μL，重復(fù)離心超濾操作2~3 次。

（6）收集產(chǎn)物：加 0.2 mL 1×PBS至Filter device 中，輕輕吹打。將 Filter device 倒置于另一個(gè) Collection tube中，1000×g 離心 2 min。收集Collection tube 中的溶液，即為生物素標(biāo)記的蛋白。

3. 蛋白保存及使用

向標(biāo)記后的蛋白中加入0.05~0.2% Proclin 300或0.05%die氮化鈉，及蛋白穩(wěn)定劑（如 0.1% BSA），于2~8°C 避光保存，可穩(wěn)定保存半年。或加入等體積甘油于-20°C 存儲(chǔ)，可穩(wěn)定保存半年。

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